Einen ersten Höhepunkt stellt die in der Schweiz einzigartige Werkgruppe italienischer Malerei des Trecento und Quattrocento dar, darunter als Schlüsselwerk die Maestà von Duccio di Buoninsegna.

Die frühe Neuzeit ist mit herausragenden Werken der Berner Malerei von der Spätgotik bis zum Realismus des 19. Jahrhunderts vertreten, von Niklaus Manuel Deutsch über Joseph Heintz, Joseph Plepp, Albrecht Kauw und Joseph Werner bis hin zu Albert Anker, von dem das Kunstmuseum die bedeutendste Werkgruppe überhaupt besitzt.

Die Bestände ab der Mitte des 19. Jahrhunderts sind von internationalem Format: Die Entwicklung der modernen Kunst, vom Impressionismus bis zu Rothko und Pollock, kann fast lückenlos mit Meisterwerken veranschaulicht werden. Höhepunkte sind Einzelwerke von Manet, Cézanne, Monet, Pissarro, Renoir, van Gogh und Toulouse-Lautrec, die Werkgruppen zu Kubismus, Blauem Reiter, Brücke, Bauhaus und Surrealimus.

Daneben sind natürlich Schweizer Künstler wie Ferdinand Hodler, Cuno Amiet und Giovanni Giacometti mit Hauptwerken aller Schaffensepochen vertreten. Auch nach dem Umzug der Paul-Klee-Stiftung ins neue Zentrum ist  Paul Klee im Kunstmuseum immer noch mit ausserordentlichen Beispielen seines Schaffens präsent.

Ein Schwerpunkt des Museums ist weiter das Sammeln und Erforschen so genannter Outsider-Kunst. Einer ihrer weltweit prominentesten Vertreter ist der ehemalige Berner Bauernknecht Adolf Wölfli (1864-1930), dessen Nachlass von der 1975 gegründeten Adolf Wölfli-Stiftung betreut wird.

Das Kunstmuseum Bern gehört zu den wenigen öffentlichen Sammlungen in der Schweiz, die seit langem explizit Kunst von Frauen fördern. Dafür stehen Namen wie Sophie Taeuber-Arp, Louise Bourgeois, Meret Oppenheim und Marina Abramovic.

Zeitgenössische Positionen sind durch umfangreiche Werkgruppen von Bernhard Luginbühl, Franz Gertsch, James Lee Byars, Markus Raetz, Urs Lüthi, Dieter Roth oder Sigmar Polke vertreten.